朗伯比尔定律(Lambert-Beer law)是分光光度法的基本定律，是描述物质对某一波长光吸收的强弱与吸光物质的浓度及其厚度间的关系。

当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度L成正比，而与透过率T成反比。

• 比尔—朗伯定律数学表达式：

A=lg(1/T)=KLc

A为吸光度，T为透过率，是出射光强度（I）比入射光强度(I0)，T=I/I0。

K为摩尔吸光系数。它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关。

C为吸光物质的浓度，单位为mol/L，L为吸收层厚度，单位为cm。

• 适用条件：

(1) 入射光为平行单色光且垂直照射；

(2) 吸光物质为均匀非散射体系；

(3) 吸光质点之间无相互作用；

(4) 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收，无荧光和光化学现象发生；

(5) 适用范围：吸光度在0.2~0.8之间。

01UV测试中的应用

由朗伯比尔定律可知，吸光度A与样品浓度C（同样厚度）是成正比关系的，因此这就UV仪器分析中基本理论，利用标准曲线法进行未知样品浓度的测定。

标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如标准溶液的浓度)，称为普通变量，纵坐标(Y)表示仪器的响应值(这里指的是吸光度)，称为随机变量。当X取值为X1, X2,…… Xn时，仪器测得的Y值分别为Y1, Y2, …… Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示X与Y之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试样中被测物质的含量，标准曲线不能任意延长。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太大或太小，应能近似地反映测量的精度。

02固定波长法

标准曲线的建立（UV定量测试方法的运用，以软件LabSolutions UV-Vis为例）。

图示：Labsolutions UV-Vis软件定量法测试界面

图示：定量[参数]窗口

选择“固定波长”，指定波长1的具体波长，右侧标准曲线中“零截距”一般不需要勾选，如果勾选了，标准曲线会强制过原点（0,0），但实际测试中，标准曲线的截距多少还是会有的，这和标准样品的空白有较大的关系。

只有当标准样品只有一个时，这时如果还需要进行测试，可以勾选“零截距”，两点才能形成一条直线。

03双波长法

总氮的测定：硝酸根离子在紫外线波长220nm有特征性的量大吸收，但是也有其他溶解性有机物的干扰，而在275nm波长则基本没有吸收值。因此，可分别于220和275nm处测出吸光度。A220及A275按下式求出校正吸光度A：

A= A220—2×A275

校正吸光度A与溶液浓度符合朗伯比尔定律，从而绘制标准曲线以测试未知样品浓度。

图示：[登录波长]窗口

在“登录波长”窗口设置所需要的波长220、275nm。

图示：定量[参数]窗口

在定量参数窗口就要设置“双波长差”的计算方法，并在275nm波长的因子处设置为2，从而校正吸光度A=AWL220-2×AWL275，其余部分就和单波长测试标准曲线设置类似。后续测试时，有个重要的差异，由于这是双波长，就需要使用“基线”功能，设置波长范围覆盖220、275nm，例如200~280nm。否则使用“自动调零”的话，就只是当前波长调零，而不能同时使220、275nm吸光度都调零。

04K因子测试方法

图示：定量[参数]窗口

如果已经知道标准曲线的具体公式，可以选择“指定标准曲线因子（K因子）”法，再指定K0、K1的值，就可以在软件中生成标准曲线，后续直接测试未知样品的吸光度就能计算出相应的浓度。