来源：分析测试百科网

　　聚合酶链反应即 PCR 实验，是最基础最常用的实验之一，很多科研汪刚进入实验室的时候，经常被要求尽快掌握好 PCR 技术。

　　要想做好PCR实验，你要掌握真正的技术

　　1. 增加 PCR 的特异性

　　（1）引物设计

　　这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件：

　　a 足够长，18-24 bp，以保证特异性. 当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性, 并且降低产量；

　　b GC % 40 % ~~~~ 60 %；

　　c 5'端和中间序列要多 GC，以增加稳定性；

　　d 避免 3' 端 GC 富集， 最后 3 个 BASE 不要有 GC，或者最后 5 个有 3 个不要是 GC；

　　e 避免 3' 端的互补，否则容易造成二聚体。

　　f 避免 3' 端的错配；

　　g 避免内部形成二级结构；

　　（2）优化试剂浓度

　　a. 镁离子

　　一般的情况下 Mg 的浓度在 0.5-5 mM 之间调整，同样要记住的是在调整了 dNTPs 的浓度后要相应的调整 Mg 离子的浓度。对实时定量 PCR，使用 3 到 5 mM 带有荧光探针的镁离子溶液。

　　b. 其他的离子

　　NH4+ K+ 都会影响 PCR。增加 K+ 的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了 PCR 的严谨性 ( stringency )。NH4+ 也有相同的作用.。

　　2. 增加PCR的保真性

　　（1）高保真酶

　　高温 DNA POLYMERASE 是以单链 DNA 或 RNA 为模板，在 dNTP 和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按 3'-5'方向合成 DNA. 包括 3 种类型：

　　a.5' -3' 方向的 DNA 合成能力，没有 3'-5' 方向的外切酶特性，如 Taq 及其突变体. 这类酶的合成能力强，因为他不纠正合成中出现的突变；

　　b. 与 a 类似，有合成活性，没有 3-5 的外切活性，但他们能以 RNA 为模板，合成 DNA，如 Tth DNA Polymerase；

　　c. 有 DNA 聚合活性，没有逆转录活性，但有 3-5 方向的外切酶活性，如 pfu DNA Polymerase，可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比 Taq DNA 聚合酶低。

　　（2）其他因素

　　除了酶，高浓度的 dNTP 或镁离子会降低忠实性。将 dNTP 的浓度从 200 μM 降低到 25-50 μM 可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的 PCR 循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。