来源：分析测试百科网

1、前言

从目前的情况来看，大多数的微生物实验室采用的是一些传统的细菌鉴定手段，如革兰氏染色、氧化酶等生化反应，或者是采用梅里埃公司的API和Vitek鉴定系统。这些检测手段都很浪费时间，通常需要六到八个小时，对于一些难培养的细菌鉴定来说，将会耗费更多的时间。有时候我们也会采用一些分子生物学上的手段，来展开鉴定，如对16SrDNA展开分析。不过16SrDNA对于生长慢和难培养的细菌鉴定起来比较困难，对于实验人员的素质要求和经验比较高，价格也是昂贵的。MALDI-TOF MS的出现，或许将改变这种现有的诊断模式，其方法简便、快速以及可靠的优点必将得到普遍认同。这项技术将会将细菌的鉴定时间由以小时计算推进到以分钟计算，听起来就令人感到兴奋。

MALDI-TOF MS（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）即基质辅助激光解析电离飞行时间质谱作为一种新型的软电离生物质谱技术，被越来越多的应用于生命科学等领域的多个学科，不仅具有灵敏度高、准确度高且易于自动化等优势，而且较之传统的检测方法，MALDI-TOF MS检测的快速、对急性病例或特殊病原菌的准确检测及其在耐药方面的应用使其拥有更好的发展前景。

应用传统的化学方法对常见细菌进行鉴定，仍然是现在大多数实验室所采取的鉴定方法，但是对于一些难鉴定菌及培养要求苛刻的病原体，常规鉴定方法并不能满足实验室及临床的应用。然而，MALDI-TOF MS技术不仅能够快速鉴定，而且也为微需氧菌、厌氧菌、真菌、结核分枝杆菌及病毒等难鉴定、难培养病原体的鉴定弥补了生化鉴定方面的不足。目前，MALDITOF MS在食源性监测及科研等中的应用日益增多，也被临床实验室逐渐所采纳。

2、MALDI-TOF MS的基本原理

2.1 MALDI-TOF MS的组成

仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）、飞行时间质量分析器（TOF）。

2.2 MALDI-TOF MS的工作原理

基于不同的微生物具有不同的蛋白质谱图，而MALDI-TOF MS可电离相对分子质量为100~1000000的生物分子，电离后不同的离子又具有不同的质荷比，质谱也能找出种间和株间特异保守峰作为生物标记从而将其区分开，所以MALDI的具体原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离，适用于混合物及生物大分子的测定。而TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比检测离子。根据检测的结果与数据库中的参考图谱进行比对，从而得到结果。

3、MALDI-TOF MS的常规应用

3.1 MALDI-TOF MS对常见细菌的鉴定

对于临床中的不同标本如鼻咽分泌物、咽拭子、脑脊液、胸腹水、肛拭子及尿液等进行微生物培养后，将其菌落进行质谱鉴定，据统计MALDI-TOF MS能准确鉴定大部分革兰阳性菌和革兰阴性菌如葡萄球菌属、链球菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属、肠杆菌科细菌、变形杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、不动杆菌属、耶尔森菌属等。

张明新等复苏560株临床分离株，应用MALDI-TOF MS鉴定临床常见病原菌。MALDI-TOF MS与Vitek2Compact鉴定结果比较，G+细菌鉴定符合率为94.6％（246／260），G-细菌鉴定符合率为96.7％（174／180），酵母菌鉴定符合率为95.0％（57／60），肠道致病菌鉴定符合率为93.3％（56／60）。15株鉴定结果不符的菌株经16SrDNA测序确认，结果与Vitek-Compact和MALDI-TOF MS鉴定符合率分别为26.7％（4／15）和66.7％（10／15）。Sogawa K等将从临床实验室获得的468株菌落直接点靶进行MALDI-TOF MS鉴定，物种和属各级的识别率分别为91.7%（429/468）和97.0%（454/468）。

由于不动杆菌属需要不同的治疗措施，所以对其的快速且准确的诊断是十分重要的。Kishii K等应用MALDI-TOF MS对分离自血液中的123例不动杆菌属标本的研究显示：能够确认到种的有106/123（86.2%），而16/123（13.0%）只能鉴定到不动杆菌属。并对106株标本进行了基因序列测定，其中89/106（84.0%）与MALDI-TOF MS的鉴定是一致的。研究还显示这123株属于13种不动杆菌属，而且皮氏不动杆菌的感染率超过了鲍曼不动杆菌达到42/12 3（34.1%）。

3.2 MALDI-TOF MS对微需氧及厌氧菌的鉴定

近年来随着临床对微需氧及厌氧菌的日益重视，对其的检测研究逐渐增多，其培养阳性率也逐渐提高。但微需氧及厌氧菌对培养条件及鉴定条件要求苛刻，传统生化鉴定技术很难满足临床实验室快速准确鉴定微需氧及厌氧菌的要求。对于空肠弯曲菌等微需氧菌的鉴定目前仍缺乏统一的鉴定方法，利用MALDI-TOF MS技术对其进行鉴定漏诊率及所需时间都大大降低，既满足了临床对确诊的需要，也满足了临床快速鉴定的要求。

袁梁等人利用MALDI-TOF MS技术对56株厌氧菌进行了研究显示：53株MALDI-TOF MS与16SrRNA基因序列鉴定结果一致，符合率达94.6%，传统生化Vitek32 ANI鉴定卡45株鉴定结果与16SrRNA基因序列鉴定结果一致，符合率为80.4%。与基因鉴定结果相比较，MALDI-TOF MS技术鉴定符合率高于传统生化鉴定技术。

3.3 MALDI-TOF MS对真菌的鉴定

目前，临床上对于真菌的鉴定主要有传统的微生物鉴定法、Vitek微生物鉴定系统及MALDI-TOF MS法。传统微生物鉴定中对于真菌一般有压片、染色镜检，观察其菌丝和孢子，接种沙保罗培养基（固体和液体），咖马伽显色培养基，由于真菌生长周期长，传统方法无法满足临床对于病原菌快速而准确鉴定的要求。

有报道称，对于临床分离得到的241株真菌通过MALDI-TOF MS进行鉴定（包括念珠菌、隐球菌、红酵母），92%均能准确鉴定到种的水平。在真菌的鉴定方面许多研究证实MALDI-TOF MS能够用来鉴定多种真菌，尤其是临床比较常见酵母菌，也能对青霉、曲霉、镰刀菌、以及皮肤真菌等进行鉴定。

3.4 MALDI-TOF MS对结核及非典型分枝杆菌的检测

由于结核及非典型分枝杆菌的营养要求高（必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊罗氏培养基上才能生长良好）、生长缓慢（14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5w才出现肉眼可见的菌落），传统微生物鉴定只能通过抗酸染色、培养、PCR等对其进行鉴定，不仅费时，而且PCR对试验条件和人员素质要求均较高，成本较大。而MALDI-TOF MS则可以快速而准确的获取其特异的蛋白质谱图，通过与数据库的比对快速得出结果。

此外，与VITEK-MS系统相比，应用MALDI-TOF MS对临床分离株进行鉴别，从基因水平和物种水平两方面的鉴定率分别为87.3%和62.8%，均优于VITEK-MS系统。运用16SrRNA进行基因测序无法区分脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌，而质谱则可以，其鉴定率为57.1%（12/21）。

3.5 MALDI-TOF MS对病毒的检测

至今为止，应用MALDI-TOF MS技术来检测病毒方面的报道很少，但有报道可用MALDI-TOF MS来鉴定病毒融合蛋白，来确定病毒株的毒力、病毒糖蛋白、衣壳蛋白。还有报道用MALDI-TOF MS通过病毒蛋白不同的分子量从病毒基因组水平来鉴别特定限制性片段，或者用来鉴别特异的基因突变。

3.6 MALDI-TOF MS对细菌的毒力因子鉴定

应用MALDI-TOF MS对金黄色葡萄球菌的毒力因子鉴定已有报道，然而需要先在SDS-PAGE上提取蛋白。近日，Bittar等，成功的使用MALDI-TOF MS鉴定出了PVL（Panton–Valentine leukocidin）阳性的葡萄球菌。应用ClinProToolsTM软件（布鲁克道尔顿，德国）分析，在57株PVL阴性金葡和24株PVL阳性金葡中，PVL阳性株能在4448m/z质谱峰处检测到特异质谱峰。应用此特异质谱峰筛选34株金葡，发现2株PVL阳性株。此种方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为100%、90.6、40和100%。

4、深度应用

4.1 MALDI-TOF MS对血培养的直接鉴定

菌血症、败血症及脓毒血症等血流感染的感染率逐年增高，发病急、致死率高使其对快速微生物鉴定的需求更加紧迫。

Katherine Bond等研究报道了应用MALDI-TOF MS直接对血阳性瓶进行鉴定的应用。与传统培养需要24h或更多时间的检测技术相比，MALDI-TOF MS可以在4~6小时内对血液标本中的致病菌进行检测和鉴定。荷兰的Marc Bonten团队研究显示对血液标本中的致病菌进行MALDI-TOF MS鉴定的平均时间是16小时，与传统的检测方法需要45小时相比大大缩短了检测时间，也为临床合理应用抗生素治疗提供了可靠的依据。美国休斯敦的James Musser团队的研究数据显示应用MALDI-TOF MS后，脓毒血症患者的住院时间平均缩短了3天。

Foster AG等从需氧、厌氧和儿童瓶三种血培养瓶中选出253份阳性标本利用MALDITOF MS进行检测，分别有92.1%和88.1%被鉴定到属和种；其中161株革兰阳性菌分别有95.7%和90.1%被鉴定到属和种；92株革兰阴性菌分别有84.7%和83.7%被鉴定到属和种。

Jamal W等对160例血培养阳性标本进行传统方法检测和MALDI-TOF MS直接鉴定。Bruker SepsiTyper kitTM（STK）和传统方法的检出率分别为114（75.6%）和150（93%），利用STK鉴定中，36例鉴定不准确或未鉴定出，其中5例分值>2.000，31例分值不可信<1.7。8株真菌中准确鉴定4株。包括提取步骤，使用STK的平均时间是35分钟。

有研究报道显示，利用MALDI-TOF MS技术直接鉴定血培养瓶中的真菌， 95.9%（187/195）的白色念珠菌与传统培养鉴定方法一致，86.5%（128/148）的非白色念珠菌与传统培养鉴定方法一致，且平均时间在30分钟左右。

4.2 MALDI-TOF MS对尿液的直接鉴定

传统尿液微生物的检测依赖于涂片及细菌的培养，但临床更倾向于快速的检测技术，现在常规使用的技术并不能满足临床的需要。MALDI-TOF MS技术的优势可以弥补传统方法的不足。

Ferreira L等对尿路感染的尿液标本分别进行传统检测和MALDI-TOF MS鉴定。260例尿液标本被UF-1000i、细菌培养和MALDI-TOF MS都鉴定为阳性；20例标本被UF-1000i鉴定为阳性，而培养和MALDI-TOFMS都鉴定为阴性。220份标本细菌生长>105CFU/ml，其中202例（91.8%）鉴定到种，204例（92.7%）鉴定到属，鉴定率最高的是大肠杆菌173株。173株大肠杆菌中MALDI-TOF MS鉴定出163株（94.2%）。

有学者对收集到的1040份尿液标本进行了尿细菌培养及直接质谱鉴定，其结果显示1040份标本中共鉴定出细菌的标本有52 6份，其中包括培养出1种菌的标本430份，尿病原菌直接质谱鉴定率为92.7%（430/464）；培养出2种菌的标本96份，尿病原菌直接质谱鉴定率为75%（96/128）；尿病原菌直接质谱鉴定法鉴定出的细菌与尿细菌培养法鉴定出的细菌菌种一致，符合率为100/100。王新华等结合UF-1000i 和MALDI-TOF MS直接对1456例尿路感染的尿液标本进行鉴定，鉴定的准确率为1381（94.8%）。

4.3 质谱与核酸研究