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液质联用法测定大鼠血浆中齐墩果酸的浓度

　　齐墩果酸（oleanolic acid，OA） 为一种五环三萜类化合物，以游离体和配糖体的形式广泛分布于青叶胆、女贞子等双子叶植物的 60 个科约 190 种植物中[1-2]。本文建立并优化了大鼠血浆中齐墩果酸浓度的高效液相色谱-质谱联用测定法。方法快速简便，灵敏度高，重现性和专属性好，结果满意。 
　　1 材料 
　　1.1 药品与试剂 
　　OA标准品（中国药品生物制品鉴定所批号：110709-200505），内罗红霉素（roxithromycin，ROX，中国药品生物制品检定所，批号130351-0608），甲醇（色谱纯），试验用水为乐百氏纯净水，其余试剂均为分析纯。 
　　1.2 仪器 
　　岛津LCMS-2010A液-质谱联用仪，含自动进样器、在线脱气系统、柱温箱、二元梯度泵，Sigma 3K30台式超高速冷冻离心机。 
　　1.3 动物 
　　SD大鼠，雄性，体重（200±20）g，南昌大学医学院实验动物中心提供。 
　　2 方法 
　　2.1 质谱条件 
　　色谱柱：Shimadzu Pack VP-ODS C18 5μm×150mm×2.0mmI.D；流动相：乙腈∶水（含0.1%冰醋酸铵）=53∶47（v/v）；流速：0.2mL/min 柱温：35℃；采集方式：选择性离子监测；离子极性：负离子；离子化方式：电喷雾离子化；检测对象：齐墩果酸M/Z=455.70；罗红霉素M/Z=734.30；检测电压：1.5kV，雾化气体流速 2.0L/min；曲型脱溶剂装置温度250℃；加热块温度 250℃。 
　　2.2 血浆样品的处理 
　　取0.1mL血浆，精密加入20μL内标ROX，40μL 0.1mol/L Na2CO3溶液，混匀后加4.0mL乙酸乙酯，振荡4min，4500rpm离心10min，取上清液3.0mL，置50℃干浴锅中氮气挥干，以0.3mL甲醇溶解残渣，再经18000 rpm 离心10 min后，取5μL进样，用峰面积进行定量分析。 
　　3 结果 
　　3.1 色谱行为 
　　血浆中杂质对测定无明显干扰，ROX峰保留时间为1.9min，OA峰保留时间为1.5min。专属性色谱图见图1。 
　　3.2 线性范围及最低定量下限 
　　取离心管数支，分别精密加入不同量的OA标准溶液20μL，再加入空白血浆180μL，涡旋混匀成25，50，100，200，400，600，1200ng/mL标准含药血浆，按“2.2”项操作，记录色谱图，计算OA峰面积和内标峰面积的比值，计算OA面积（Aa） 和内标峰面积（Ai） 的比值f。以f 对c作回归计算，得回归方程：Y = 0.01343X-0.06263（r=0.9997）。线性范围为：25～1200ng/mL按上述条件测得OA在血浆中的最低定量限为25ng/mL。 
　　图1 （左边为OA，右边为内标）A：空白血浆色谱图； 
　　B：空白血浆加入内标ROX和OA色谱图C大鼠给予OA的血浆加入内标ROX样品色谱图 
　　3.3 回收率及精密度试验 
　　配制浓度为50、400、1000 ng/mL OA标准血样，按本文“2.2”项操作，每一浓度制备并测定5个样品，3d连续制备并测定3个分析批。计算其回收率及精密度符合要求 
　　3.4 稳定性试验 
　　精密配制含OA50、400、1000ng/mL的标准血样，分别经由血样处理后室温放置0、6 、12h及在-20 ℃冷冻保存3d后测定血样中OA的浓度，考察其稳定性，结果表明稳定性良好。 
　　4 结论 
　　本文建立并优化了大鼠血清中齐墩果酸浓度的高效液相色谱-质谱联用测定法。方法快速简便，灵敏度高，重现性和专属性好。