来源：分析测试百科网

一、实验目的

   1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

   2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 

   3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理

    1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm

可见光：400-780 nm，（可被人们的眼睛所感觉）

特点：带光谱、分子光谱

应用：定性分析-最大吸收波长；

      定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）

a.定性分析原理：

  吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.

b.定量分析原理：

    根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

    定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:

    各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

三、仪器与试剂

    TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管、标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。

四、实验步骤

   1.基本操作

    （1）启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。

    （2）用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）.

    （3）在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描）

    （4）将两个均装有0.9%NaCl溶液的25px石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。

   2.吸收曲线的制作:

     将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。 

   3.标准曲线的制作：

     在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A₂₇₈，记录所得读数。

  4.样品测定： 

      配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A₂₇₈=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为3.0505mg/mL。

 六、注意事项

PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。

2.在测量前应把机器预热半小时。

3.吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。

4.溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。

5.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。

6.在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。