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，黑色箭头表示的物体 AB 经过物镜等之后在相机上成像。由于光的衍射，物体上的点如 A、B，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑，如右侧的同心圆所示。根据光学中的瑞利判据，1873 年，德国物理学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）推算出，显微镜能分辨的物体上两点 A、B 的最小距离 h 为：

h = 0.61λ/(n*sinθ)

       这个公式就是光学显微镜的分辨率公式，或称为光学衍射极限。其中，λ为光的波长，n为物方的折射率，θ为物体与物镜边缘连线和光轴的夹角。(n*sinθ)也常称为数值孔径，简写为 NA。目前常用的高倍物镜（100x）NA值为 1.49，所以对于可见光，比如波长 500 纳米的绿光，计算得到显微镜的分辨率约为 200 纳米。因此可知，即使再提高物镜的放大倍率，也不能提高显微镜的分辨率。而 200 纳米这个数值也就通常被人称作衍射极限。如上图中（a）（b）（c）所示，当两个点逐渐靠近到一个程度时，我们就很难分辨该光斑是一个点还是两个点叠加在一起了（如图（c）），更别提其空间/立体位置关系了。