来源：分析测试百科网

pcr测序反应

(1) 取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂 测定模板管 标准对照管

bigdye mix 1μl 1μl

待测的质粒dna 1μl －

pgem-3zf (+) 双链dna － 1μl

待测dna的正向引物 1μl －

m13(-21)引物 － 1μl

灭菌去离子水 2μl 2μl

总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环，pcr循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。

(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

电泳前测序pcr产物的处理

(1) 加入12μl的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3) 在pcr仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。

分析或打印出彩色测序图谱

上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kv预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

序列分析

仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

处理仪器

测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。