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三维重构

做过TEM的小伙伴都知道，透射电镜得到的是二维投影图像，要得到三维的结构，就要通过一系列建模、变换，这个过程就是三维重构。上面提到的第3位诺奖得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非对称颗粒从二维投影到三维结构的方法（随机圆锥倾斜法），奠定了冷冻电镜单颗粒三维重构的基本原理，如图3（b）所示^{[3, 4]}。随后，开发了SPIDER程序用于冷冻电镜结构分析，得到了广泛应用。目前，冷冻电镜领域广泛应用的三维重构软件是上面剑桥大学Richard Henderson老爷子实验室的Sjors Scheres博士（据说当时Sjors Scheres博士没有一篇NSC论文，但Richard Henderson教授仍独具慧眼将其引进到剑桥MRC分子生物学实验室）开发的RELLION。

然而，即便打通了任督二脉（上述3个关键流程），冷冻电镜并没有立即获得今天这样的爆红。这主要是因为（1）冷冻电镜的信噪比低，（2）图像摄取时漂移，使得可以获取的二维投影仍是模糊状态，因此仅能应用于有限的生物大分子单颗粒的结构解析，严重限制了其应用。直到2013年，加州大学旧金山分校（UCSF）的程亦凡教授等将直接电子探测器（DDD）用于记录冷冻电镜的单颗粒图像，大大提高了信噪比与分辨率，实现了近原子分辨率（3.3 Å）的膜蛋白结构的解析，才引起了业界的轰动，如图5所示。随后，冷冻电镜技术在生物大分子3D结构解析中无往不利，堪称屠龙宝刀。目前，美国NIH的Subramaniam实验室成功解析了谷氨酸脱氢酶的结构，分辨率达到了1.8 Å，创造了最高分辨率的世界纪录。

可见，正是3位诺奖科学家在各自领域内完成突破性的工作：Jacques Dubochet突破了冷冻技术的瓶颈，Joachim Frank在三维重构算法上做出了原创性贡献，Richard Henderson首次使用低电子剂量成像完成了生物大分子3D结构的解析并一直在理论上指导冷冻电镜技术的发展，最终形成了0到1的飞跃，铸造了冷冻电镜这一把屠龙宝刀，开创了结构生物学研究的新局面。上述3位科学家获得诺贝尔奖章可以说当之无愧！