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电子断层成像技术可用来研究细胞器或细胞结构，以及一些巨大的超分子复合物。对于电子断层成像技术，有两方面很重要，第一，是使用透射电镜进行断层成像，获得三维物体的二维投影像；第二是低温保存生物样品的天然状态。通过对同一样品每间隔一定角度拍摄一幅照片，通常是在-70°到+70°的角度之间，得到几十幅代表同一结构不同角度下的二维投影像，然后对这一系列投影像对正，用加权背投影的方法获得样品的空间结构。然而获得足够的一系列倾斜样品的断层图证明是对技术上的一个挑战。主要问题是究竟需要多少断层图。我们获得的断层图像的分辨率依赖于样品的厚度和获得的相应投影图像的数量。这样，如果想获得厚度为0.25μm样品的分子分辨率（0.5nm）的图像，大约需要160张相同空间的投影图。该方法显示的是完整结构系统的静态结构信息，而冷冻电镜单粒子法是从成千上万的单粒子图象中重构出超微分子结构，是以生物分子的功能动力学为特点。样品制备同样很关键。冷冻含水技术虽说日趋成熟，但对电子断层成像来说仍面临挑战：1、样品的厚度超出了冷冻电镜的适用范围，这就要求有特殊的设备，采用高压冷冻或高速冷冻（slam-freezing）

2、冰冻含水样品很难制成超薄切片，世界上只有少数几个实验室能做到，

3、该技术需要对同一样品进行重复照射，自组装断层成像技术使电子辐射累计量达最低减少对样品的损伤。

然而，这样的保护措施（样品不被固定也不染色）也有一定的弊端：包埋在无定型冰中的生物样品产生的投影像对比度很低，而且随着样品的厚度增加而降低。为此，通过在非常规的欠焦状态下成像已获得较高的对比度，也就是10nm或更高。另一种解决的方法就是通过滤掉非弹性散射电子来减少电子束对样品的损伤，对于较厚的样品可以使用较高的加速电压比如300KV以增加其穿透能力。

电子断层成像术的主要优势在于解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构 ,如线粒体、高尔基体、细胞等 ,这些不具全同性的粒子结构是无法用其他方法解析的。通过电子断层成像术得到的细胞结构 ,现在已能到 5ｎｍ左右的分辨率 ,在这个分辨率下分子量大于 400ｋＤ的结构可以精确定位在细胞中。