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2013年，冷冻电镜技术的突破给结构生物学领域带来了一场完美的风暴，迅速席卷了结构生物学领域，传统X射线、传统晶体学长期无法解决的许多重要大型复合体及膜蛋白的原子分辨率结构，一个个被迅速解决，纷纷强势占领顶级期刊和各大媒体版面，比如程亦凡博士、施一公博士、杨茂君博士、柳正峰博士所解析的原子分辨率重要复合体结构，震惊世界。

这场冷冻电镜革命的特点是：不需要结晶且需要样品量极少，即可迅速解析大型蛋白复合体原子分辨率三维结构。这场电子显微学分辨率革命的突破有两个关键技术：直接电子相机（其中算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要贡献）和三维重构软件。

引领这些技术突破的背后离不开三位冷冻电镜领域的开拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分别在基本理论、重构算法和实验方面的早期重要贡献。

我本人与这三位科学家都有曾过面对面的交流，也是读他们的文章进入这个领域的，下面简要谈谈他们的贡献。

电子显微镜于1931年发明，但在生物学领域的应用滞后于材料科学，原因在于生物样品含水分才会稳定，而电子显微镜必须在高真空下才能工作，因此如何制作高分辨率生物电镜样品是个技术瓶颈。传统的重金属负染技术，可以让重金属包被蛋白表面，然后脱水干燥制作适合真空成像的样品，但这会导致样品分辨率降低（至多保存1.5纳米）。

1968年，英国剑桥大学MRC实验室的Klug博士和他的学生DeRosier开创了基于负染的噬菌体病毒的电镜三维重构技术（Klug 博士获1982年诺贝尔化学奖）。但如何保持生物样品原子分辨率结构又适合电镜成像呢？加州大学伯克利分校的Robert Glaeser博士和他学生Ken Taylor 于1974年首次提出并测试了冷冻含水生物样品的电镜成像，可以有效降低辐照损伤对高分辨率结构破坏和维持高真空，实现高分辨率成像的新思路，这就是冷冻电镜（CryoEM）的雏形。

► 冷冻电镜样品制作流程，图片来自creative-biostructure.com

1982年，Dubochet 博士领导的小组开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品，随着冷台技术的开发，冷冻电镜技术正式推广开来。

在Klug博士提出的三维重构技术基础上，MRC实验室的Richard Henderson博士（物理学及X射线晶体学背景）跟同事Unwin 博士1975年开创了二维电子晶体学三维重构技术，随后应用该技术技术解析了第一个膜蛋白细菌视觉紫红质蛋白的三维结构，1990达到3.5埃，这是一个非常了不起的工作，但是第一个类似的膜蛋白结构的诺贝尔奖还是被X射线晶体学家米歇尔于1988年夺走了。二维晶体最大问题在于很难长出二维晶体，因而应用范围很窄，且容易被X射线晶体学家抢了饭碗（本人刚入行第一个薄三维晶体项目就被抢了）。

上世纪90年代，Henderson博士转向了刚兴起的另一项CryoEM三维重构技术，即Joachim Frank 博士发展的单颗粒分析重构技术，无需结晶就可以对一系列蛋白或复合体颗粒直接成像，对位平均分类，然后三维重构。Henderson 博士凭借他深厚的物理学及电子显微学功底，以及非凡的洞察力，提出实现原子分辨率CryoEM技术的可行性，在理论上做了一系列超前的预见，比如电子束引起的样品漂移必须解决才能实现原子分辨率，为后期直接电子相机的突破指明了方向，他本人也投身于直接电子相机的开发。

因此，在这场电镜分辨率的革命中，Henderson博士是个不折不扣的发起者。另外，三维重构新算法的突破也有Henderson 博士的独具慧眼有关，Sjors Scheres博士在没有很强论文情况下被他看中招募到MRC后因为开发经典的Relion 三维重构算法大放异彩。

最后，我们再介绍一下发展冷冻电镜单颗粒三维重构技术的Joachim Frank博士，他也是物理学背景。Frank 博士是单颗粒分析鼻祖，单颗粒三维重构算法及软件Spider的作者。

Frank 师从德国著名的电子显微学家Hoppe博士，Hoppe学派主张对任意形状样品直接三维重构，后来的电子断层三维重构及cryoEM三维重构技术都与他的早期思想有关。Frank博士提出基于各个分散的全同颗粒（蛋白）的二维投影照片，经过分类对位平均，然后三维重构获得蛋白的三维结构，发展了一系列算法并编写软件（SPIDER）实现无需结晶的蛋白质三维结构解析技术。尤其在核糖体三维重构方面有一系列的重要开创性工作，可惜当年核糖体结构诺贝尔奖没有给他。现在给他在cryoEM单颗粒三维重构的一个诺贝尔奖，实至名归。