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共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。

共聚焦与传统显微镜的原理差别在于照明方式不同：传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图像，有一定的时间延迟。

共聚焦显微镜应用领域涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。

其中在生物领域：共聚焦显微镜应用于细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。