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　　分析DNA甲基化的高通量方法大多依赖参考基因组，而许多物种不一定有。最近，奥地利的研究人员就开发出一种方法，在没有参考基因组的情况下分析DNA甲基化。这项成果于本周发表在《Cell Reports》上。

　　文章的第一作者是奥地利科学院CeMM分子医学研究中心的Johanna Klughammer。她及其同事将简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）与一种名为RefFreeDMA的应用程序相结合。这种程序能从RRBS读取中推断出基因组，并发现样品中差异甲基化的区域。

　　她们开发的这个流程依赖于脊椎动物中DNA甲基化的非随机分布，大多数甲基化都位于CpG位点。在她们这个方法中，DNA先通过限制性内切酶Mspl和/或Taql消化，这两种酶分别切割C^CGG和T^CGA，并且对甲基化不敏感。之后，这些消化后的序列被用来创建RRBS测序文库。

　　研究人员指出，他们利用九个物种（人、小鼠、大鼠、牛、狗、鸡、鲤鱼、鲈鱼和斑马鱼），验证和优化了96孔RRBS方法的基因组覆盖度和样品通量，将所覆盖的CpG位点数量从250万个提高到400万个。

　　RefFreeDMA是一个基于Linux的软件流水线，利用了RRBS读取的特点，如明确的起始和中止点。通过汇集特定物种中所有样品的RRBS读取，这个应用程序推断出每个集群的一致序列。在胞嘧啶和胸腺嘧啶同时存在的情况下，研究人员指出，胞嘧啶被保留，因为这可能反映了甲基化的胞嘧啶。

　　一旦生成了推导的基因组，研究人员便利用BSMAP/RRBSMPA将读取与一种自定义的DNA甲基化检出脚本相比对，以评估每个CpG位点的甲基化部分。随后，研究人员将差异甲基化的读取进行排序。那些排名靠前的读取被导出为FASTA/FASTQ文件，通过已注释的相关基因组来进行生物学解释。

　　为了验证这种方法，Klughammer及其同事将其应用在三个物种（人、牛和鲤鱼）的44个样品中，并比较了无参考和有参考的分析。他们发现，对于两种方法，CpG位点的平均DNA甲基化水平在很大程度上是相似的。同时，推导的基因组也大体反映了参考基因组。例如，1,522,786个推导基因组片段中的1,254,324个可比对到人类基因组。

　　“我们对代表性染色体的比对位置进行作图时，发现这两种方法有着很好的一致性，而对于所有样品和所有物种，这两种方法所获得的DNA甲基化值也高度一致，”Klughammer及其同事在文中写道。

　　研究人员指出，这种方法不仅能够应用于野生种群，也能够应用于农业和水产养殖的样品。